(Гете Иоганн Вольфганг)
Субмиллиметровое излучение и эякулят барана в эксперименте.
Актуальность и новизна.
Изучение влияния облучения биологических объектов импульсными лазерами низкой интенсивности в субмиллиметровых диапазонах на примере сперматозоидов млекопитающих открывает новые возможности в понимании качественных и функциональных характеристики клеток. Такое воздействие, например, можно будет использовать: в методах культивирования in vitro для получения относительно чистых культур стволовых клеток полипотентного класса костного мозга млекопитающих.
Согласно концепции тканевых ингибиторов-кейлонов (Bullough, 1975; Lee SJ, McPherron AC., 1999; Plikus MV, Mayer JA et al., 2008; Lander AD, Gokoffski KK et al., 2009), малодифференцированные клетки способны непрерывно размножаться, но процесс сдерживается ингибиторами, выделяемыми дифференцированными клетками.
Увеличение активности дифференцирования и убыли количества зрелых клеток (Ol'shevskaia IuS, Kozlov AS, et al., 2009), за счет направленного лазерного воздействия в субмиллиметровом диапазоне, способствует к ускоренному созреванию балластных клеток и к снижению концентрации
ингибиторов пролиферации.
Таким образом, можно предположить, что данный процесс будет способствовать увеличению клеточных делений малодифференцированных клеток и омоложению клеточного состава монослоя с увеличением по средневзвешенному показателю доли стволовых клеток плюрипотентного класса; в диагностике гипофертильности неясного генеза у мужчин (при соответствии показателей спермограммы референтным значениям) по различиям в ответе сперматозоидов на лазерное излучение; в процедурах IVF при лечении бесплодных пар при подготовке сперматозоидов к оплодотворению ооцитов; в различных областях практической медицины для ускорения регенерационных клеточных процессов, в том числе роста, деления, миграции клеток, а также для коррекции механизмов тканевой регуляции пролиферации с нормализацией структуры и динамики тканевого гомеостаза; в сельском хозяйстве при использовании крио-консервированной спермы для осеменения сельскохозяйственных животных и повышения качества спермы после хранения и так далее.
Материалы и методы.
Вкачестве биологического материала выбран нативный эякулят барана и его криоконсервированные порции. Электромагнитное воздействие в субмиллиметровом диапазоне на биологический объект проводилось с использованием газоразрядного лазера с рабочим веществом HCN и следующими основными техническими характеристиками: мощность: 1,5 mW, экспозиции в 1, 5 и 10 минут, частота излучения от 0,893 до 1,0 THz (с длиной волны около 0,337 мм). Нативный эякулят барана транспортировался в термостате при температуре около 37° C, а его криоконсервированные порции в термосе на льду.
Исследуемый материал нативного эякулята после перемешивания разлит по 0,3 мл в 8 капсулаторок пластмассовых диаметром 5 мм.
Криокосервированная сперма барана в виде замороженных таблеток была быстро разложена по одной таблетке в подобные капсулаторки (8 штук) и снова помещена на лед. Пробы извлекались из термостата с заданной температурой (37° C) перед воздействием лазера. Криоконсервированные образцы размораживали непосредственно перед воздействием лазерного излучения и затем помещались в специальный термостойкий планшет. После воздействия лазером экспериментальные пробы эякулята возвращались обратно в термостат. Каждая проба облучалась в дубликатах. Половина экспериментальных проб эякулята в дальнейшем использовалась для изучения интенсивности хемилюминесценции (ХЛ).
Для определения концентрации нативной спермы образец был разведен в 1000 раз. Концентрация образца составила 1,8×109 сперматозоидов в 1,0 мл. Затем подсчитано количество клеток в 5 больших квадратах камеры Горяева, расположенных по диагонали (сосчитывались только сперматозоиды, головки которых лежали внутри квадрата).
Для определения концентрации сперматозоидов
по стандартной методике в криоконсервированной сперме одна таблетка должна содержать около 80×106 сперматозоидов в 1 мл. Поэтому образцы спермы были разведены в 100 раз и исследованы в камере Горяева. Концентрация сперматозоидов в образцах составила от 40 млн./мл до 1800 млн./мл.
Все образцы были двукратно отмыты буфером Тироде (pH 7,4, центрифугирование при 1500 оборотов/мин. два раза по 5 мин.). Затем осадок клеток был ресуспендирован этим же буфером для получения взвеси клеток с последующим исследованием скорости образования активных кислородных радикалов.
Определение хемилюминесценции образцов осуществлялось на хемилюминометре Lum-5773 (Россия), с помощью которого проводили количественный учет световой эмиссии, продуцируемой в системе буфер-сперматозоиды-люминол за 10 минут.
Полученные результаты пересчитывали на количество импульсов, продуцируемых 20×106 сперматозоидов за 1 мин.
Для микроскопирования на флуоресцентном микроскопе (Axio Imager M2, объектив 63×/1,4 Oil, Carl Zeiss, Germany) доставленный эякулят был разделен на три порции: с окрашиванием образцов флуоресцентным красителем JC-1 (в концентрации 1,0 моль×10-3) со временем экспозиции около 10 мин; с окрашиванием по Рубенкову с фиксацией клеток для выявления аномалий морфологического строения; с окрашиванием акридиновым оранжевым для изучения влияния различной экспозиции лазерного излучения на целостность ядерного хроматина.
Изучалось влияние различной экспозиции лазера на митохондрии сперматозоидов, а также морфологию клеток в живой культуре (капля под покровным стеклом без фиксации).
Результаты и выводы.
Физиологически здоровые сперматозоиды демонстрируют слабую, часто на уровне фона или ниже, хемилюминесценцию (ХЛ). При увеличении в эякулятах доли патологически измененных, поврежденных или клеток со слабой подвижностью интенсивность ХЛ значительно увеличивается (на 1-3 порядка), что отражает скорость продуцирования клетками реактивных кислородных радикалов. Гиперпродукция кислородных радикалов может привести к повреждению структурных компонентов сперматозоида. Эти клетки особенно чувствительны к кислородным радикалам, т.к. их плазматическая мембрана содержит большое количество полиненасыщенных жирных кислот, легко вступающих в реакцию перекисного окисления липидов (ПОЛ-процесс), что уменьшает целостность мембраны, влияет на фосфорилирование аксонемных белков и приводит к иммобилизации спермиев. Таким образом, повышение ХЛ сперматозоидами свидетельствует о развитии «оксидативного стресса».
В исследуемых пробах при экспозиции в 1 мин. наблюдалась ХЛ на уровне фона или меньше нуля, что дает основание предполагать позитивное влияние субмиллиметрового излучения на биологический объект. Напротив, увеличение экспозиции до 5 мин. и 10 мин. повышал ХЛ сперматозоидами, что свидетельствует о развитии у них «оксидативного стресса». ХЛ клеток нативной
спермы меньше, чем криоконсервированных, что может быть связано с тем, что остатки криопротектора глицерин-лактоза-желток (ГЛЖ) могут также инициировать ХЛ люминола (C8H7N3O2).
В нативных образцах эякулята барана без воздействия лазерного излучения с красителем JC-1 наблюдалось до 5 %, а в криоконсервированных до 10 % сперматозоидов с повреждениями акросомы и хвоста (контроль). Морфология клеток после облучения с экспозицией в 1 мин. совпадала с морфологией контрольных образцов. Более длительные экспозиции воздействия субмиллиметрового облучения значительно увеличивали число сперматозоидов с более выраженными повреждениями клеточных структур. Морфология по Рубенкову показала, что в нативных и подвергнутых облучению образцах с экспозицией в 1 мин. доля поврежденных клеток составила менее 5 %. Напротив, в образцах с облучением в 5 мин. и 10 мин. морфологическая картина значительно ухудшалась, а поврежденных клеток наблюдалось более 20 %. Следует также отметить, что в криоконсервированных образцах отмечалась лучшая морфология клеток (более четкие контуры акросомы), чем в нативных. Морфология с окрашиванием акридином оранжевым без особенностей, хорошо видна головка сперматозоида, но повреждений мембран при таком окрашивании и нарушений конденсации ядерного хроматина не выявлено.
Планы и перспективы.
Вближайшее время запланированы эксперименты с эякулятом барана для продолжения изучения влияния электромагнитных волн субмиллиметрового диапазона на биообъект в промодулированном режиме (с частотой модуляции
от 1 до 300 Гц).
Полученные результаты позволят приблизиться к пониманию возможности регулирования механизмов клеточной пролиферации и обеспечения клеточного гомеостаза как фактора тканевой устойчивости.
Фото. 1. Нативный эякулят. Контроль. Морфология клеток без особых изменений. (по Рубенкову)
Фото. 2. Криоконсервированный эякулят. Контроль. Морфология клеток без особых изменений. (по Рубенкову)
Фото. 3. Нативный эякулят. Воздействие лазера с экспозицией облучения 1 минута. Морфология клеток на уровне контроля, поврежденных клеток менее 5 %. (по Рубенкову)
Фото. 4. Криоконсервированные сперматозоиды. Воздействие лазера с экспозицией облучения 1 минута. Морфология клеток на уровне контроля, поврежденных клеток менее 5 %. (по Рубенкову)
Фото. 5. Нативный эякулят. Воздействие лазера с экспозицией облучения 5 минут. Повреждение акросомальной мембраны у более 20 % клеток. (по Рубенкову)
Фото. 6. Нативный эякулят. Воздействие лазера с экспозицией облучения 1 минута. Морфология клеток без особых изменений. Нарушений конденсации ядерного хроматина не выявлено. (акридин)
Фото. 7. Криоконсервированные сперматозоиды. Воздействие с экспозицией облучения 1 минута. Морфология клеток без изменений. Нарушений конденсации ядерного хроматина не выявлено. (акридин)
![[Valid RSS]](images/valid-rss.gif "Validate my RSS feed")