(Гете Иоганн Вольфганг)
стволовые клетки костного мозга млекопитающих. общие положения.
На современном этапе развития медицины все более актуальной становится проблема создания действенных средств антиканцерогенной защиты. Актуальность разработки инновационных методов получения плюрипотентных культур с высоким витальным и пластическим потенциалом обусловлена необходимостью поиска новых путей борьбы с раком. Эти методы находят свое применение не только в онкологии, но и при самых различных патологиях нервной, сердечнососудистой, гормональной, иммунной, пищеварительной систем и т.д. Их уникальный потенциал сконцентрирован в высоких репопуляционных и регенеративных свойствах плюрипотентной культуры, которые позволяют в кратчайший срок восстановить тканевой дефект и создать благоприятные возможности для нормального функционирования органа или системы. Предлагаемая методика получения аутогенной культуры плюрипотентного класса позволяет получить достаточную клеточную массу при гомогенности популяции клеток по фенотипу, что и определяет ее эффективность в коррекции различных патологических состояний. Для получения первичного аутогенного материала выполняется стандартная методика забора пункции из верхнего края тазово-подвздошной кости пациента под локальной анестезией в амбулаторных условиях. Аспират подвергается тщательному микроскопическому исследованию и «высевается» на композитную агар-агаровую подложку. Главной особенностью разработанной нами методики (Укрпатент для полезной модели № 25184) является ее способность создания in vitro условий «пробирочного иммунитета». Для этого в питательный раствор добавляются тиазолсодержащие соединения (Укрпатент для изобретения № 81883), а композитная подложка насыщается полифенолами и ионами серебра. Таким образом, формируется дуплексная защита выращиваемых клеток без необходимости их периодических перепосевов. Все это создает условия для длительного роста и выборочной утилизации зрелых типов клеток в динамике культивирования. В результате получаем плюрипотентную культуру с однородной по фенотипическим признакам клеточной массой. Полученная культура не имеет
мутагенных субпопуляций и иммунореактивных агентов, что делает ее абсолютно безопасной для последующих аутотрансплантаций. После 20-минутного контроля на аллергические реакции культура может быть введена пациенту одним из трех способов (внутривенно, внутримышечно, и интраперитонеально). Самым приемлемым способом введения является интраперитонеальный. Проведенные исследования показывают, что только половина из введенных клеток мигрирует к кровеносной системе, в то время как другая половина распластывается по перитонеальной поверхности, формируя культуральный монослой. Обширная поверхность брюшины, богатая васкуляризация брюшинного листка, оптимальные физические параметры в брюшной полости создают идеальные условия для продолжительного роста и экзогенного депонирования трансплантированных клеток. Таким образом, формируется эндогенный источник аутогенных стволовых клеток плюрипотентного класса, который с одной стороны будет постоянно восполнять клеточный дефицит, например, иммунокомпетентных клеток при онкологических заболеваниях, а с другой, мигрируя к костному мозгу, генерировать их новую линию, устойчивую к нейтрализации атипичными или злокачественными клетками. В результате формируется мощная антиканцерогенная «атака» всеми звеньями иммунитета и локализация очага патогенного поражения раковым заболеванием. Не менее важна роль получаемой аутогенной плюрипотентной культуры в хирургии. Ее способность к восстановлению дефектных или иссеченных участков тканей обеспечит быстрое восстановление физиологических функций тканей в постоперационном периоде, ускорит период заживления и ликвидирует расстройства, вызванные операционной травмой. Кроме того, наши исследования и проведенные тестирования плюрипотентной культуры стволовых клеток костного мозга млекопитающих (фибробласты) в виде гомогената показали свою эффективность в композитных лекарственных или косметических формах (гели, кремы, эмульсии и т.п.) для эффективного лечения дерматологической патологии и омоложения кожи.
Самоорганизация и активное стремление к унифицированности составляют единую основу нашего мироздания. Микрожизнь настолько подобна макромиру как мы нашему собственному отражению в зеркале.
Пространственно-временные характеристики и структура биосферы макромира с каждым годом открывают все новые и новые достоверные параллели с микромиром, что помогает исследователям разных стран приблизиться к пониманию его научных проблем посредством создания различных биологических моделей. Основная идея новой методики культивирования в создании относительных асептических условий для длительного роста клеточной массы. Аналогом модели могут служить естественные условия пребывания клеток в кровеносной системе млекопитающих, а ее суть в необходимости создать в условиях in vitro собственную иммунную систему, способную защищать клетки от внешнего негативного воздействия (вирусы, бактерии, грибы и прочие микроорганизмы). Для проведения культивирования клеток разработано достаточно пригодных питательных сред (например, 2MEM или RPMY-1640), которые воссоздадут их среду пребывания подобно в цельной крови. Как и для живого макроорганизма использование антибиотиков при культивировании клеток крайне нежелательно из-за их негативного воздействия на иммунитет. При соблюдении относительных асептических условий в течение всего срока культивирования происходят процессы превращения менее дифференцированных типов клеток культуры к более зрелым типам. Эти процессы повлекут за собой ослабление адгезивных
как межклеточных связей, так и связей клеток с подложкой (например, агар-агаром), что в свою очередь высвободит такие клетки в питательный раствор, где их рост прекращается, и они погибают.
Суть нашего метода обеззараживания культуры состоит в том, что при выращивании клеточного материала в питательный раствор добавляются тиазолсодержащие соединения, а подложка насыщается сложной композицией из полифенолов и ионов серебра Ag2+ по оригинальной методике. Подобное сочетание обеспечило устойчивый обеззараживающий эффект на всем протяжении выращивания клеточной массы. Проведенные исследования показали возможность адгезии стволовых клеток на агар-агаровой подложке без использования «фидерного слоя». Наши выводы исходили из того, что агар-агар – это макромолекулы, полимеры. В гелевой фазе они представляют собой переплетения макромолекул, свободные концы которых могут выходить на поверхность гелеобразной фазы и образовывать ворсинчато-подобные структуры. Поскольку молекулы агар-агара построены из углеводных фрагментов, они имеют большое количество гидроксильных групп, способных образовывать водородные связи, как с прилежащими молекулами воды, так и с компонентами клеточных мембран. В связи с этим культивируемые клетки могут прилипать к поверхности субстрата за счет специфических химических взаимодействий. Вероятны образования водородных связей между гидроксильными группами молекул агар-агара и фосфатными «головками» фосфолипидов и белковыми молекулами, входящими в состав мембран клеток.
Введение: данные работы описывают возможность коррекции радиационно-индуцированного иммунодефицита у подопытных животных на изогенных и ксеногенных моделях с использованием плюрипотентных стволовых клеток костного мозга млекопитающих, выращенных in vitro.
Новая биотехнология проста и недорога, давая большую клеточную массу по сравнению со стандартными методами культивирования и обеспечивая их относительную однородность по фенотипическим признакам. Физиологическое действие полученной культуры продемонстрировано в экспериментах на изо- и ксеномоделях с интраперитонеальным введением клеточной суспензии в условиях прогрессирующего пострадиационного иммунодефицитного состояния. Дальнейшее изучение данного феномена показало гарантированную защиту опытных животных от последствий воздействия Х-облучения и развития пострадиационого иммунодефицита.
Объект исследования: изучить возможность использования ГСК плюрипотентного класса костного мозга млекопитающих в коррекции иммунодефицитного состояния, вызванного X-облучением подопытных животных.
Цель исследований: экспериментальная разработка методологии селективного культивирования ГСК и патогенетическое обоснование возможности их использования для коррекции пострадиационного иммунодефицитного состояния.
Методы исследования: гематологические (показатели в крови лейкоцитов, нейтрофилов и лимфоцитов); микроскопические (оптическая микроскопия, электронная микроскопия) – для цитометрической и цитоморфологической идентификации стволовых клеток (СК); иммунологические – для определения маркеров CD 34, CD 90, CD 117, CD 133, Sca-1 характерных для СК и CD4+ и CD8+, для T-лимфоцитов; физиологические – для определения поведенческих реакций и общего состояния экспериментальных животных; методы параметрической и непараметрической статистики.
Научная новизна: Впервые предложена оригинальная методология селективного культивирования ГСК плюрипотентного класса, пригодная для воспроизведения в условиях лечебных заведений, прежде всего, при аутогенных трансплантациях. Обоснована биотехнология интенсивного выращивания однородной по фенотипическим признакам культуры ГСК плюрипотентного класса, которую возможно использовать при коррекции иммунодефицитных состояний разного генеза, например, вызванных общим X-облучением. Патогенетично показана такая возможность.
Прикладная область: биология, генетика, медицина [хирургический имплантат; онкология
(например, рак молочной железы, лейкоз и т.д.); различные иммуннодефициты; иммунодиагностика (использование фибробластов); эндокринология (например, диабет, ожирение и т.п.); инфекционные болезни (например, острый вирусный гепатит С) и прочее], патологическая физиология, косметология и т.д.
Практическое значение: разработан новый метод выращивания однородной по фенотипическим признакам культуры ГСК плюрипотентного класса без мутаций, который может быть воспроизведен в условиях больниц, клиник и госпиталей со значительным снижением себестоимости выполненных процедур. Этот метод открывает перспективы широкого использования такого типа клеток в клинической практике без проблем тканевой совместимости. Новый подход показал свою эффективность в коррекции последствий радиации (пострадиационный иммунодефицит). Экспериментальные работы выполнены более чем на 700 инбредных животных (крысы линии Wistar-Kyoto и мыши линии BALB/c). В опытных группах с Х-облучением и интраперитонеальным введением культуры плюрипотентных стволовых клеток костного мозга выживаемость составила 100 %.
Исследования с перевитыми опухолями показали, что данная культура своими репопуляционными и регенерирующими свойствами способствует восстановлению адекватного иммунного ответа и обеспечивает эффективную антиканцерогенную защиту, прекращая рост опухолевой ткани. Данная биотехнология успешно может быть использования для аутотрансплантаций, например, при различных хирургических операциях с резекцией любой части органа для восстановления его клеточного потенциала и функциональной способности; в заместительной терапии при различных формах диабета. Разработана методика получения культуры инсулин-продуцирующих клеток. Для этого на определенном этапе выращивания плюрипотентная культура дополнительно обрабатывается in vitro специальными медиаторами, экстрагированными из свиной панкреатической ткани. Конечная культура содержит преимущественно инсулин-продуцирующие клетки, пригодные для аутотрансплантации пациенту с диабетом. Кроме того, получены достоверные результаты использования фибробластоподобных стволовых клеток, взятых от молодых свиней в омолаживающей косметологии и для регенерации ожоговых травм кожи в комбинации с гидрофобными или гидрофильными гелями.
Внедрение в практику: Результаты исследования внедрены в научно-исследовательскую и педагогическую практику кафедр патологической физиологии ХНМУ, ЛугГМУ, СумГУ, ОГМУ, ВГУЗУ «УМСА» (г. Полтава) и лаборатории репродуктивной эндокринологии Института проблем эндокринной патологии АМН Украины им. В.Я. Данилевского (г. Харьков).






![Validate my RSS feed [Valid RSS]](images/valid-rss.gif)